01. 固　定（組織・蛋白質を保持し、抗原の流出を防ぐ。組織の種類・大きさなどによる）
　　　　　　　4％パラフォルムアルデヒド in 0.1M PBS
　　　　　　　4ﾟC〜室温、30分

01'. 洗　浄　PBS　室温、30分×3回

02. Triton処理（浸透性を高める、培養細胞には必須、透過電顕試料には一般に用いない）
　　　　　　　0.3％ Triton X-100 in PBS
　　　　　　　室温、10分

02'. 洗　浄　PBS　室温、10分×3回

03. ブロッキング（抗体の非特異的結合を抑える；二次抗体を作る際に抗原の免疫に用いた動物の正常血清、またはBSAかスキムミルク）
　　　　　　　1％スキムミルク in PBS
　　　　　　　室温、1時間

03'. 洗　浄　PBS　室温、10分×3回

04. 一次抗体反応（検出したい目的の分子に対する（結合する）抗体）
　　　　　　　in PBS（希釈倍率は抗体、実験条件により異なる）
　　　　　　　4ﾟC、湿箱内で、一晩（16〜18時間）

04'. 洗　浄　PBS　室温、10分×3回

05. 二次抗体反応（一次抗体を認識し、ビオチン標識された抗体）
　　　　　例1）一次抗体がウサギに免疫された抗体の場合：
　　　　　　　　　1:200 ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG抗体（Vector社#BA-1000） in PBS
　　　　　例2）一次抗体がマウスに免疫された抗体の場合：
　　　　　　　　　1:200 ビオチン化ウマ抗マウスIgG抗体（Vector社#BA-2000） in PBS
　　　　　　　室温、1時間

05'. 洗　浄　PBS　室温、10分×3回

06. ABC（Avidin-Biotin Complex）反応
　　　　　　　（Vector社#PK-6100, VECTASTAIN Elite ABC KIT STANDARD使用）
　　　　　　　（A:Avidin or streptavidin, B:Biotinylated horseradish peroxydase）
　　　　　　　ABC溶液：
　　　　　　　　　A液とB液とをPBSに対して(A:B:PBS)=(1:1:100)の割合であらかじめ混和し、
　　　　　　　　　室温で30分間静置しアビジン-ビオチン複合体を形成させておいたおいたもの
　　　　　　　室温、1時間

06'. 洗　浄　PBS　室温、10分×3回

07. DAB発色反応
　　　　　　　0.05M Tris-HCl (pH7.6)　室温　10分

　　　　　　　0.02％ (10 mg/50 ml) DAB (3,3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride) in Tris-HCl,
　　　　　　　　+0.005％ H₂O₂ (使用直前に30％ H₂O₂を15 micro l/100 ml加える)
　　　　　　　発色具合を見計らいながら反応時間を決める（早いもので数分、遅いものでは数時間）

07'. 洗　浄（反応停止）　PBS　室温、10分×3回

08. 脱　水
　　　　　　　アルコール上昇系列（70,80,90,95,100,100％EtOH）
　　　　　　　各5分（適宜液を動かす）

09. 透　徹
　　　　　　　キシレンI、キシレンII
　　　　　　　各10分

10. 封　入
　　　　　　　エンテランおよびカバーグラス
　　　

0.5% ゼラチン水溶液（温めて溶かす）
完全に溶けてから冷却

続いて0.05% CrK(SO₄)₂・12H₂O, クロムミョウバンを溶かす
（ゼラチン・クロムミョウバン液）

ステンレスラックに入れたスライドグラスを、ゼラチン・クロムミョウバン液に浸け（数秒）、引き上げる

乾燥（ほこり等がかからないように注意）

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