葉内CO2葉の内部構造の測定
光学顕微鏡や透過型電子顕微鏡を利用して葉の内部構造を解析する方法を解説します。何かご意見やご質問がありましたら半場までメールでご連絡下さい。
１．固定包埋
１. 切片の切り出し
- 光合成を測定した後、葉をアルミホイルでおおって一晩おき、炭水化物を消費させる
- 葉を氷上に置く
- カミソリをアセトンで脱脂し、葉の一部（葉脈を避ける）から1mm*2mmの切片を切り出す
- エッペンチューブに切片を入れて氷上に置く
２. 包埋
準備する試薬
- 100mMリン酸バッファ（pH7.2）1 L
- Na2HPO4（無水） 9.9 g
- KH2PO4 4.05 g を1 Lの蒸留水に溶かし、pHメータでpHを7.2（25℃）に調整。4℃で保存
- グルタルアルデヒド 5%溶液（使用直前に調整）
- グルタルアルデヒド50%のアンプル（2 mL）を、100mMリン酸バッファ 38 mLに溶かし、0〜4℃に冷却する
- 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%エタノール（4℃で保存）、80%、90%、100%エタノール（室温で保存）。
グルタルアルデヒドによる前固定
- 切片の入ったエッペンチューブを氷上に載せ、グルタルアルデヒド5%溶液（0〜4℃に冷却したもの）を適量入れる。
- エバポレータで脱気して切片を沈める（沈まないときは脱気を2〜3回繰り返す）
- グルタルアルデヒド溶液を交換し、エバポレータで脱気したまま4℃で24時間放置する
オスミウム酸による後固定
- グルタルアルデヒドを廃液入れに捨て、100mMリン酸バッファを適量入れて4℃で20分放置。バッファの交換を4回繰り返してグルタルアルデヒドを完全に洗い流す
- リン酸バッファを捨て、2%オスミウム酸を切片が浸る程度に入れる（手袋をしてドラフト中で作業する）。
- チューブのふたをパラフィルムで巻いて、4℃で2時間放置。
脱水
- オスミウム酸を廃液入れに捨てる
- 冷蒸留水を適量入れ、4℃で20分放置。蒸留水の入れ替えを2回繰り返す
- 冷蒸留水を捨て、4℃の下で、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%エタノールで各30分おく
- 室温に戻し、80%、90%、100%エタノールで各30分おく
プロピレンオキサイド置換（省略してもよい）
- 100%エタノールを捨てる
- プロピレンオキサイド：エタノール=１：１を入れて室温で30分放置
- 100%プロピレンオキサイドに交換、室温で30分放置。液の交換を3回繰り返す
樹脂置換
Spurrの樹脂
以下の割合で、秤の上で調合してスターラーでよく混ぜ、エバポレータで十分に脱気する（以下の量はエッペンチューブで20本分程度）。樹脂が吸湿しないよう、量り取る部屋はクーラーを入れるなどの工夫が必要。適宜分注して-80℃で保存しておく。解凍するときは吸湿しないようデシケータの中で行う。樹脂には発がん性があるので、作業は手袋をはめて行う。
ERL 4206 10.0g
DER 7366.0g
NSA 26.0g
DMAE 0.4g
- プロピレンオキサイドを捨てる
- 樹脂：プロピレンオキサイド=１：3を入れ、4℃で5-6時間放置
- 樹脂：プロピレンオキサイド=１：1を入れ、4℃で5-6時間放置
- 樹脂：プロピレンオキサイド= 3：1を入れ、4℃で5-6時間放置
- 100%樹脂に入れ替えて、切片が沈んだらエバポレータで脱気し、室温で4時間放置。
- 新しい樹脂を包埋板に少量入れ、デシケータ中で室温でしばらくおく
- 包埋板に切片を入れ、上から多めに樹脂を加え、切片の位置を整える
- 70℃のオーブンで24時間重合させる 重合が終わったサンプルは吸湿しないようデシケータで保存する
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2. 光学顕微鏡による観察とデータ解析
切片の作成
- 光学顕微鏡観察用の切片の作成方法は、後述の超薄切片の作成方法に準ずる。ただし、切片の厚さは0.7 μm に設定する。
切片の引き上げと染色
- エタノールで洗浄したスライドグラスを用意し、蒸留水を一滴スポイトでのせておく
- 切片は白金ループ（針金で作ってアセトンで洗浄したものでもよい）で引き上げ、スライドグラスの水滴の上に移す
- スライドグラスを80℃のホットプレートに載せ、水分を蒸発させる
- トルイジンブルー1％溶液（1％ホウ酸水溶液+トルイジンブルー1％）をたらし、20秒程度（乾かない程度に）染色する （注）トルイジンブルー溶液は長期間使用しなかったときには濾過する必要がある。沈殿が生じていて、切片をだめにすることがある。
- 洗びんを使って蒸留水を吹き付けてよく洗い、簡単に水分を取り除く（キムワイプなどを使用）
- ホットプレートで乾燥させる
- オイキット液（カバーガラス封入用の溶液）を１滴たらし、気泡が入らないようにしながらカバーグラスを載せ、乾燥させる
光学顕微鏡写真の撮影と内部構造の解析
使用機器：オリンパスBX51（本体）＋オリンパスDP11（デジタルカメラ） 使用ソフトウエア：NIHimage 空隙率、細胞間隙に接する葉肉細胞や葉緑体表面積を計算する方法を紹介します。
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| 元画像 |
Awhole |
Amesopohyll |
Lmes |
- 葉肉細胞がひとつひとつはっきり見分けられる程度の倍率で、葉の断面の光学顕微鏡写真を撮影し、適当な部分を抽出する。
- 抽出した部分について、表皮を除いた部分が占める面積を求める。手書きで写真をトレースし、スキャナで読み込んでNIHimageで塗りつぶした後に面積を計算する（ Awhole )。
- 3葉肉細胞が占める面積を求める。手書きで写真をトレースし、スキャナで読み込んでNIHimageで塗りつぶした後に面積を計算する（ Amesopohyll )。
空隙率 = ( Awhole - Amesopohyll ) / Awhole
- 細胞間隙に接する葉肉細胞の輪郭をトレースし、スキャナで読み込んでNIHimageでskeletonize後に面積を計算することによって輪郭の長さを求める（Lmes ）。柵状組織と海綿状組織が明確に区別できる場合には、それぞれについて輪郭の長さを計算する（Lp、Ls）。同様に、細胞間隙に接する葉緑体の輪郭をトレースし面積を計算する（Lc ）。
- 柵状組織の長軸（y）と短軸（x）、海綿状組織の長軸（r）と短軸（s）の長さを測る。いくつかの細胞の平均値を求める。これらの値から、柵状組織と海面状組織のF値 Fp 、Fs を計算する。この計算式は、細胞を上面と底面が平らな円筒状であると仮定した場合の式である（Thain 1983, J Exp Bot 34: 87-94）。
Fp = π / (2 + 0.467 * x/y )
Fs = π / (2 + 0.467 * s/r )
- 葉全体のF値を計算する。
F = Fp * Lp / Lmes + Fs * Ls / Lmes
- 葉肉細胞の表面積Smesおよび葉緑体表面積Scは、次の式で計算できる。w は分析した葉の横断面の長さ。
Smes = Lmes / w * F
Sc = Lc / Lmes * Smes
（注）葉肉細胞や葉緑体表面積の計算にあたっては多くの仮定が含まれており、また光学顕微鏡写真上でさまざまな長さを正確に測定するのは難しいため、計算値にはかなりの誤差が含まれていることに注意する必要がある。
3. 透過型電子顕微鏡による観察
超薄切片の作成
ガラスナイフを作る（ナイフメーカー7800B、LKB社）
- ガラス板は流水を使ってガーゼで洗い、蒸留水をかけて乾かしておく
- ガラス板をセットする（なめらかな方が表）
- 手前にあるつまみ2の位置をあわせる（四角：//、三角形：|25|）
- 左のハンドルを引きながら右に回してストッパーをはずす
- カッターの刃を奥におしこむ
- ガラス板の下部を白い部分に、左部をストッパーにあわせる
- 左のハンドルをゆっくり下げてガラス板を固定する
- カッターを手前に引いてガラス板に傷をつける
- 右のハンドルをゆっくり右に回すとガラスが割れる
- 右のハンドルをゆるめる
- 左のハンドルを上げる
- カッターの刃を戻す まずガラスを正方形に切り、次に対角線で切って、直角三角形の刃をつくる。超薄切片用には、刃先のよいものだけを使用する。刃先がよくないものは、トリミング用。
- ガラスナイフの刃にビニールテープを巻いてボートをつくり、つなぎ目にはマニキュアを塗って乾かす。
- ボートの端がナイフのエッジより1/4mm上になるようにし、ボートの上面は刃の下面より少し下がるようにセットする（ミクロトームにつけたときにボートが水平になるようにする、図 。 このとき、刃に触れないように注意する。ガラスナイフはできるだけ切片を作る直前に作成する。保存するときはデシケータで。
（注）切れ味のよいガラスナイフを作成するのは大変難しいです。また、ガラスナイフは保存している間にも劣化する上、使用限度も30回程度しかありません。頻繁に切片を作成する必要がある場合には、高価ですがダイヤモンドナイフを購入した方が研究の効率がはるかに向上するのでおすすめです。光学顕微鏡の観察のためにはヒストダイヤモンドナイフ（スイスdiatome社、イーエムジャパンで取り扱い。刃幅4mmで24万円）が便利です。3年以上使用していますがまだ再研磨の必要はありません。
ウルトラミクロトームで切片を切る（Reichert-Nissei ULTRACUT Nを使用）
- 荒削り ヤスリや、アセトン脱脂したカミソリで、試料面の周囲の樹脂を削り落とす。まず水平方向に、試料面が露出しない程度に慎重に削り、次に周りの樹脂を削る。ブロックの高さは0.5mm程度（シャープペンの芯の幅）。
- トリミング ブロックをミクロトームにセットして、試料面が幅0.5mm程度の台形（または角を落とした正方形）になるようにトリミングする。まず水平方向に削って切片の上部を露呈させ、同時に面をなめらかに磨く（削る深さは最小限にする：切片に適した部分はブロックの端近く）。次に上下の辺が平行になるように90度づつカプセルを回転させながら周囲を削る。 注：トリミングの状態は切片の善し悪しに影響するので丁寧に行う。トリミングに使用するナイフは Ultraスーパーナイフ（STK-2、イーエムジャパンで取り扱い。硬質ステンレス刃、55000円）が非常に便利。ほぼ永久的に使用できる。
- 試料ブロックをミクロトームにセットする 試料ブロックがナイフの刃より下面に来るようにしておく
- ガラスナイフをミクロトームにセットする
- ガラスナイフに蒸留水を入れる はじめに盛り上がる程度に入れてナイフエッジになじませ、次にシリンジで吸い上げて、水面が少しへこみ、全面が白く光る程度に水位を調節する ナイフの周囲に付いた水滴はろ紙でぬぐう（キムワイプを使わない：ほこりが付着する）。
- 試料ブロックとナイフの位置合わせ
- ナイフのクランプをゆるめてナイフを試料ブロックに近づけ、クランプを締める。
- ナイフエッジと薄切面がよく見えるように照明を調節する。
- 顕微鏡で見ながら、ミクロトーム手前の粗動ダイヤルを使い、ナイフを切削面に近づける。薄切面の上下の辺がナイフエッジに平行になるように試料ブロックを回転させる
- ハンドホイールのレバーを最上段にし、ハンドホイールが止まるまで回す。次にハンドホイールをまわして薄切面の上端がナイフエッジより少し下側になるようにセットする。レバーを中段にする
- 薄切面の上部にナイフの影が見えるまで、左奥の微動ダイヤル（ひとめもり1-2mm）を手前に回して近づける
- ナイフの影とナイフの間の距離（輝線スリット）が薄切面の左右で同じ幅になるように、ナイフの角度を調節する
- 試料を上下に動かしたとき輝線スリットが同じ幅になるように、試料ヘッドの傾斜角調節ダイヤル（ヘッドの左側）で試料ブロックの垂直方向を調節する
- 輝線スリットが青くなるまで、微動ダイヤルでナイフエッジと薄切面を接近させる
- 切削の開始
- 試料送りをsemiにセットする（0.7 μm）。切削速度を調節する
- ハンドホイールのレバーを下段にして、自動切削を始める
- 一枚切片が切れたら、試料送りをultraにする（70nm）。
- 切片の色が灰色か銀色、金色ならば電子顕微鏡観察できる。切片が切れたら、つまようじにクロロホルムを浸して切片の上方にかざし、切片を伸展させる
- 切片の引き上げと乾燥
- 連続切片をグリッド（支持膜を張ったもの）にひきあげる（図 ）。ひきあげ法の方がよい。切片がグリッドに載っていることを確認する
- ピンセットの間からろ紙をはさんでグリッドに付いた水滴を吸い取る
- グリッドをろ紙の上に載せてしばらく乾燥させる
染色
- シャーレにパラフィルムを敷き、上に酢酸ウランの液（10ml程度）をサンプルの数だけピペットで置く。その上にグリッドを切片を下にして乗せ、ふたをして20分〜１時間染色（40℃くらいでよく染まる。染色液が古いときは長めにする。染色時間は長くても染まりすぎることはない）
- パラフィルムの上に超純水３滴を置き、順番にグリッドをくぐらせて水洗する。毎回、水分をろ紙でぬぐう（ピンセットの間からろ紙を挟んでグリッドの端に触れさせて水を吸い取る）
- シャーレにグリースを塗り、水酸化ナトリウムの粒を入れる。パラフィルムを敷き、その上に鉛染色の液（10ml程度）を1滴ピペットで置く。その上にグリッドを切片を下にして乗せ、ふたをして3分間染色。息を吹きかけないように注意する。染色は１枚づつ。
- 水洗（３と同じ、ただし煮沸してCO2を追い出した蒸留水を使う）
- シャーレに敷いたろ紙の上で乾燥
- グリッドケースに入れて保存する
染色時間や水洗の方法は、サンプルによって変わるので、適宜調節する。
透過型電子顕微鏡の取り扱い（日立 H7100）
装置の立ち上げ
- 水栓を全開にして冷却水を循環させる
- ブレーカ（部屋奥の配電盤の右端）をONにする
- パワースイッチのキーをEVAC-ONまで回す 30分くらい待って、メインパネルの表示ランプGUN、Cul、CAMERAが緑色、SPECがオレンジ色になればよい
- パワースイッチのキーをCul-ONまで回す（メインパネルの表示ランプGUN、Cul、CAMERA、SPECが緑色になっていればよい）
- 左メインパネルのREADY/OFFボタンを一回押す（点灯する）
- 左メインパネルの加速電圧切り替えボタンの75を押す（点灯）
- ディスプレイ下のHV/BEAMメータで、加速電圧が加えられていることを確認する
- HV/BEAMメータを見ながら、FILAMENTつまみを時計方向にゆっくりといっぱいまで回す
- HV/BEAMメータで、使用している加速電圧よりも移動した分（ビーム電流量）が10〜30mAになっていることを確認する
試料のセット
- 試料交換
- 試料ホルダーのセット
- 試料ホルダーの突起部を上にして、鏡筒の試料ステージの溝に合わせ、止まるところまで差し込む（5cm程度）
- 試料ホルダーを押し込みながら、排気スイッチをEVACにする（赤色点灯）
- 10秒程度で排気スイッチが緑色になるので、手早く試料ホルダーを時計回り（奥）に45°回すと、試料ホルダーが引き込まれて止まる
- 止まった位置からさらに試料ホルダーを半時計回り（手前）に15°まわすと、ホルダーがさらに引き込まれる
- メインパネルの表示ランプGUN、Cul、CAMERAが緑色、EVACがオレンジ色になればよい
- 試料ホルダーの取り出し法
- 試料ホルダーを取り出す前に、BRIGHTNESSを暗くし、FILAMENTつまみを回して電圧を下げておく
- 試料ホルダーを止まるまで引き抜き（5cm程度）、時計方向（奥）に15°まわす
- その位置からさらにホルダーを引き抜き、止まった位置からさらに半時計方向（手前）に45°回す
- しばらく待つと、排気スイッチが緑色になるので、手早く排気スイッチをAIRに切り替える
- メインパネルの表示ランプCulが点滅し、EVACが赤色に点灯すればよい
- 試料ホルダーを引き抜く。絶対に回転させないこと。
像の観察と写真撮影
- 観察
- 左メインパネル上のLOW MAGスイッチを押す
- 対物レンズ可動絞りの下のレバーを右に2回まわす
- 試料可動装置で観察する位置をきめる
- 対物レンズ可動絞りの下のレバーを左に2回まわす
- 左メインパネル上のZOOMスイッチを押す
- 左メインパネル上のBRIGHTNESSつまみで明るさを調節する。あまり長時間強い電子線をあてない方がよい。
- 左メインパネル上のMAGNIFICATIONつまみで倍率を変える
- 右メインパネル上のBRIGHTNESS CENTURINGつまみでスポットの位置をあわせ、右メインパネル上のFOCUSつまみでフォーカスをあわせる
- 写真撮影
- 写真を撮る位置と倍率を決めたら、BRIGHTNESSつまみで明るさを暗めにしておく
- ZOOMモードで、ディスプレイ下のIMAGE ROTATIONつまみをまわして視野を回転させる。写真のサイズはFULLとHALFがあるので、ディスプレイで確認する（通常はHALF）
- 右メインパネル上のWOBBLERスイッチをONにする。COARSEスイッチで粗動、微動の切り替えができる
- ルーペで像を観察し、FOCUSつまみで像の振幅が最小になるところにフォーカスをあわせる。フォーカスは少しずつずらして4枚程度撮影するとよい
- WOBBLERスイッチを止める
- コックピットの中のランプを見ながら、左メインパネル上のBRIGHTNESSつまみで明るさを調節し、緑のランプが2つとも点灯するようにする 右メインパネル上のROOM LAMP、 PANEL LAMPを消し、ディスプレイの明るさを落とす
- ディスプレイ下のPHOTOスイッチを押す。露光時間中（3秒）はパネルに触れないこと
- フィルムの取り出し（未撮影フィルムが残っている場合）
- FILAMENTつまみを回して電圧を下げる
- ACC VulTAGEを2回押して加速電圧をOFFにする
- カメラ室のふたを開け、CAMERAスイッチのCLOSEを押す。パネル上のCAMERAのクローズが点灯する
- CAMERAスイッチのAIRを押す。およそ2分でパネル上のCAMERAのAIR（赤）が点灯する
- 部屋を暗くしてからカメラ室の前ふたを開け、フィルムボックスを取り出す（少し持ち上げるようにする）
- 空のフィルムボックスをセットする
- CAMERAスイッチのEVACを押す。5分程度で排気が終わり、パネル上のCAMERAのランプが緑になる
- 現像（暗室で作業）
- 現像液（コピナール：1〜2ヶ月で交換）をバットに入れ、フィルムの乳剤が付いた方（白）を上にして、およそ20℃で2〜4分、むらにならないように現像。フィルムの端の文字が浮かび上がる程度
- 軽く水洗する
- フィルムを木の枠に乳剤面を上にしてセットし、定着液で10〜15分。むらにならないようときどきフィルムを動かす
- 30分水洗
- 乾燥
- 画像処理
- 乾燥が終わったフィルムは、透過光スキャナで300dpi程度にして画像を取り込んで処理する。 EPSON GT7600Uなどのスキャナを使用。
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